Construction of an immunosensor for human cytomegalovirus infection diagnosis

Human Cytomegalovirus (HCMV) is a herpes virus that establish a lifelong latent infection of the host, so once a person is infected, the virus persists in a state of cellular latency. Following primary infection, HCMV is excreted in body fluids and its transmission occurs through mucous contact and exposure to urine, blood transfusion and organ or bone marrow transplant procedures, being extremely difficult to identify the transmission route. HCMV infection induces no overt disease in healthy carriers, owing to effective immune control, but this infection can be severe or even fatal in immunosuppressed individuals, fetuses and newborns. Furthermore, HCMV is also relatively common among women in reproductive age, with seroprevalence ranging from 45 to 100%. The diagnosis of HCMV disease remains controversial because of the difficulty of separating patients who are asymptomatic but shedding HCMV in body fluids, from patients who have the symptomatic disease. Nowadays the most common methods for diagnosis of HCMV infection are: - serological tests based on IgM and IgG detection; - direct free HCMV detection by viral isolation and viral antigens detection in tissue, urine or saliva samples; and - PCR, which is based on amplification of selected segments of the HCMV genome and its hybridization. However, these methods are disadvantageous to be routinely used in clinical diagnosis as point of care because they require a long time to perform or are costly. Thus, there is a need to develop a method which is fast, effective and inexpensive for this virus diagnosis. As an alternative, the use of capture antibodies against the envelope glycoproteins of HCMV open the possibility of faster immunochemical methods. Glycoprotein B of HCMV (gB) is the dominant antigen in the envelope of HCMV, being possible its determination in body fluids like urine and saliva, where viral loads are higher. In consequence, the development of new methods based on the accurate detection of gB in body fluids, is of great interest. In recent years, electrochemical biosensors were widely used to determine various substances with different properties and for continuous monitoring of biological processes. Bioanalytical assays such as immunoassays (IAs), are also very important in many fields. IAs are based on antibodies ability to form complexes with the corresponding antigen, making them highly specific and selective. Thus, electrochemical immunoassays offer enhanced sensitivities and reduced instrumentation costs compared to their counterparts using other transducing elements. Also, screen-printed electrodes (SPE) contribute to develop miniaturized, easy to handle and reliable IAs devices. In addition, SPEs allow for a high-volume production of electrode systems with uniform size and geometry, ensuring measurement reproducibility at low cost. They are also very versatile, since a wide range of designs and materials can be applied in their construction. The present work describes the development of an alternative method for HCMV gB detection and quantification. It is intended the development of an immunosensor to quantify the presence of gB in urine samples. For the construction of this device we made use of a sandwich type immunoassay, wherein HCMV gB is sandwiched between a primary antibody, previously immobilized on a solid surface, and a labelled secondary antibody. Sandwich immunoassays are currently the most commonly and successfully used, mainly due to their high sensitivity and minimized background signal. Moreover, they can be performed on any kind of sensing surface, being the main criterion for these assays the availability of two antibodies with different binding sites on the target antigens. Three different immunoassays were developed. The first one was an electrochemical immunoassay, gB detection was carried out over electrochemical stripping analysis of silver nanoparticles quantitatively deposited on the immunosensor through catalysis by nanogold labels. Capture anti-gB antibodies were absorbed on screen-printed carbon electrodes, and a secondary anti-gB antibody labelled with gold nanoparticles. Nevertheless, the reproducibility of the method (RSDs ≈ 12%) was not very good owing to the random immobilization of the primary antibody on the working electrode, which resulted in small efficiency of antigen detection. Contributing to the low observed RSD was also the nonspecific deposition of silver on the sensor surface. For these reasons, it was decided the development of another approach to overcome the observed limitations. A spectrophotometric magnetic particle-based enzyme immunoassays (mpEIA) was constructed. The use of magnetic beads (MBs) functionalized with protein G (MBs-prG) as solid surface for primary antibody (mAb1) immobilization allows its oriented attachment, resulting in a more effective recognition of gB. Additionally, they improve the affinity interaction thanks to a faster assay kinetics of the dispersed beads in urine samples. The results obtained with this spectrophotometric mpEIA compared favorably to those obtained in other reports of gB detection in terms of analytical performance. Despite the advantages, ELISA readers cannot be applied as portable devices to make in situ measurements. It was then proposed an adaptation to electrochemical transduction on screen-printed electrodes. This variation aimed the achievement of a simple, sensitive, disposable and portable device. It was maintained the immunoassay scheme based on the analyte protein gB sandwiched between the primary monoclonal antibody and the secondary anti-gB-HCMV HRP labelled antibody. Similarly, magnetic particles functionalized with protein G (MBs-prG), were used. The developed immunosensor was shown to be a portable, fast, accurate, rigorous, low cost and an effective method of detecting gB in human urine samples for the valuable diagnosis/screening of HCMV infections.O citomegalovírus humano (HCMV) é o maior vírus da família Herpesviridae e da subfamília β-herpesviridae. Como em todos os vírus herpes, a infeção pelo HCMV resulta no estabelecimento de uma infeção latente ao longo da vida do hospedeiro. Assim, sempre que uma pessoa é infetada, o vírus persiste num estado de latência celular, no qual as células infetadas não produzem nenhuma partícula infeciosa do vírus, mas retêm o seu genoma completo, tendo potencial para começar a produzir partículas virais mais tarde. Após infeção primária, o HCMV é excretado em fluidos corporais, como urina, sangue, saliva, lágrimas, secreções vaginais e cervicais, sêmen e leite materno. Este processo pode durar de meses a anos. Dessa forma, o HCMV pode ser transmitido por via oral, congénita, sexual, através da exposição à urina, por transfusão de sangue e transplante de órgãos ou medula óssea, sendo extremamente difícil identificar a sua via de transmissão. O HCMV é considerado um vírus de paradoxos, pois este pode ser um potencial assassino ou um companheiro silencioso para toda a vida. Isto deve-se ao facto de a infeção pelo HCMV não induzir doença evidente em portadores saudáveis, devido a um controle imunológico efetivo, contudo a infeção pode ser grave e até fatal em indivíduos imunocomprometidos, como é o caso de transplantados, infetados pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) e aqueles com um sistema imunológico imaturo, como fetos e recém-nascidos. O HCMV também é considerado um dos mais bem-sucedidos parasitas, pois pode ser encontrado tanto em sociedades industrializadas e desenvolvidas como em grupos indígenas isolados, sendo a infeção por este vírus relativamente comum entre mulheres em idade reprodutiva, com seroprevalência variando de 45 a 100%. O diagnóstico da infeção por HCMV permanece controverso, pois é difícil separar os pacientes assintomáticos (mas que excretam HCMV em fluidos corporais) e que poderão vir a necessitar de terapia, de pacientes com doença sintomática (pneumonia ou retinite). Atualmente, os métodos laboratoriais para o diagnóstico da infeção por HCMV podem ser divididos em técnicas sorológicas e virológicas. Os métodos sorológicos são usados principalmente para avaliar os anticorpos do doador ou do recetor em situações de transplante e prever o risco de os pacientes imunocomprometidos virem a desenvolver doença sintomática. Por outro lado, o diagnóstico virológico da doença por HCMV é geralmente baseado no isolamento do vírus por métodos de cultura. Estes métodos podem ser usados mediante a utilização de amostras de sangue, urina, saliva, fezes, lágrimas, leite materno, secreções cervicais e vaginais e sêmen. Os métodos mais comuns para o diagnóstico da infeção por HCMV são então: - testes sorológicos baseados na deteção de IgM e IgG; - a deteção direta de HCMV através de isolamento viral em cultura de fibroblastos e deteção de antigénios virais em amostras de tecido, urina ou saliva; e - PCR, que se baseia na amplificação de fragmentos específicos do genoma do HCMV e sua posterior hibridização. No entanto, estes métodos apresentam alguns inconvenientes na sua aplicação como métodos de triagem em laboratórios de análises clínicas, pois requerem um longo período de tempo até à obtenção de um diagnóstico ou são caros. Assim, existe a necessidade de desenvolver um método que seja rápido, eficaz e barato para o diagnóstico deste vírus, capaz de ser usado em série. Nos últimos anos, os biossensores eletroquímicos foram amplamente utilizados na determinação de variadas substâncias com diferentes propriedades e para a monitorização contínua de processos biológicos. A deteção eletroquímica é usada devido a sua sensibilidade aprimorada e custos de instrumentação reduzidos em comparação com outros métodos de transdução. Para além disto, para desenvolver dispositivos eletroquímicos confiáveis, miniaturizados e gerenciáveis, a tecnologia screen-printing é uma escolha inteligente. Os elétrodos serigrafados (SPE) contribuem para o desenvolvimento de novos biosensores em dispositivos miniaturizados, que apresentam as vantagens acima descritas, permitindo a obtenção de resultados em poucos minutos. Adicionalmente, os SPEs permitem uma produção massiva de sistemas eletródicos com tamanho e geometria uniformes, garantindo reprodutibilidade entre medições a baixo custo. Outra mais-valia destes sensores é o facto de serem descartáveis, o que evita alguns problemas frequentemente associados aos elétrodos tradicionais, como a necessidade de um processo de limpeza. Eles são igualmente bastante versáteis, uma vez que uma ampla gama de designs e materiais podem ser aplicados para na sua construção. Na literatura podemos encontrar relatos do uso de dispositivos de deteção miniaturizados para o reconhecimento eletroquímico de sequências amplificadas de ADN provenientes de HCMV. Num desses trabalhos, baseado em elétrodos serigrafados, o ADN alvo foi adsorvido e hibridado com uma sonda de ADN biotinilada e os híbridos formados foram determinados com estreptavidina conjugada com peroxidase de rábano (HRP). Apesar da amplificação de sinal ter sido conseguida, a atividade do conjugado tem de ser controlada periodicamente devido à estabilidade da enzima. Para superar essa limitação, um outro grupo explorou outra estratégia recorrendo a marcação do ADN com nanopartículas de ouro. Apesar de terem tido melhores resultados, ambos os métodos descritos não descartam a utilização de PCR, o que os torna dispendiosos e inúteis como métodos de triagem. Um sensor piezoelétrico também foi descrito para detetar a glicoproteína do HCMV. Embora a técnica não dependa de ADN amplificado, requer o uso de instrumentação cara. Adicionalmente, um dispositivo de deteção baseado em imunofluorescência foi desenvolvido por outro grupo, aqui a amostra biológica é aplicada sobre uma superfície de ouro revestida com anticorpos específicos para HCMV (se presente em amostras biológicas, o HCMV é aprisionado na superfície deste). Ensaios positivos e negativos eram discriminados pelo uso de uma sonda fluorescente. A principal desvantagem deste dispositivo é a baixa sensibilidade que compromete a sua aplicabilidade em amostras com baixas cargas virais. Recentemente, foi ainda proposto um imunoensaio para a deteção do antígeno pp65 do HCMV utilizando HPR e nanopartículas de Pt-Pd funcionalizadas com single-walled nanohorns de carbono. A abordagem permitiu a deteção rápida de HCMV, no entanto, o uso de elétrodos de carbono vítreo não é uma alternativa prática para um método de triagem. O presente trabalho descreve o desenvolvimento de um método alternativo para a deteção e quantificação de HCMV gB. O objetivo é construir um imunossensor que determine a presença de gB em amostras de urina. O uso de anticorpos de captura contra as glicoproteínas do envelope do HCMV abre a possibilidade para o desenvolvimento de novos métodos de análise imunoquímica. A glicoproteína B do HCMV (gB) é uma glicoproteína viral que desempenha um papel crucial na entrada do vírus na célula e surge durante os estágios iniciais de uma infeção pelo mesmo vírus. A gB também é o antigénio dominante presente no envelope do HCMV, sendo possível a sua determinação em fluídos corporais como a urina e saliva, onde as cargas virais são maiores. Como consequência, o desenvolvimento de novos métodos baseados na deteção de gB em fluídos corporais é de grande interesse. Para a construção dos dispositivos, usamos sempre imunoensaios com configuração em sandwich, pois a gB é colocada entre um anticorpo primário, previamente imobilizado numa superfície sólida, e um anticorpo secundário marcado. Os imunoensaios em sandwich são atualmente os mais frequentemente usados, principalmente devido a sua alta sensibilidade e correspondente minimização de interferências. Para além disto, podem ser realizados em qualquer tipo de superfície, sendo o principal critério destes ensaios a disponibilidade de dois anticorpos com sítios de ligação diferentes para o mesmo antigénio-alvo. Durante o decorrer deste trabalho foram desenvolvidos três imunoensaios diferentes. O primeiro foi um imunoensaio eletroquímico. Foram usados anticorpos de captura anti-gB absorvidos em elétrodos de carbono serigrafados e um anticorpo secundário anti-gB marcado com nanopartículas de ouro. A deteção de gB foi realizada por meio da análise eletroquímica de nanopartículas de prata depositadas quantitativamente no imunossensor através de catálise por nanopartículas de ouro, as quais foram utilizadas como marcadores do anticorpo secundário. A reprodutibilidade do método (RSDs de cerca de 12%) não foi muito boa devido à imobilização aleatória do anticorpo primário no elétrodo de trabalho, o que resultou numa pequena eficiência de deteção do antígeno (foram observados baixos sinais considerando a grande quantidade de anticorpo utilizado). Contribui-o também para a baixa RSD observada a deposição não específica de prata na superfície do sensor. Por estas razões, decidiu-se desenvolver outra abordagem para superar as limitações observadas. Desenvolvemos um imunoensaio enzimático espectrofotométrico baseados em partículas magnéticas (mpEIA). O uso de esferas magnéticas (MBs) funcionalizadas com proteína G (MBs-prG) como superfície sólida para a imobilização do anticorpo primário (mAb1) permite a sua fixação orientada, resultando num reconhecimento mais efetivo do gB. Para além disto, estas partículas melhoram a interação de afinidade graças a uma cinética de análise mais rápida. O anticorpo secundário foi marcado com HRP para possibilitar a deteção espectrofotométrica. Os resultados obtidos com este mpEIA espectrofotométrico são favoravelmente comparáveis com outros relatos de deteção de gB em termos de desempenho analítico. No entanto, apesar das vantagens, os leitores ELISA não podem ser aplicados como dispositivos portáteis para fazer medições in situ. Para superar essa limitação, o método mpEIA mencionado acima foi adaptado à transdução eletroquímica recorrendo ao uso de elétrodos serigrafados. Esta variação visou a obtenção de um dispositivo simples, sensível, descartável e portátil. É mantido o esquema de imunoensaio com base na proteína analítica gB intercalada entre um anticorpo monoclonal primário e o anticorpo secundário anti-gB marcado com HRP, que permite igualmente deteção eletroquímica. Da mesma forma, partículas magnéticas funcionalizadas com proteína G (MBs-prG) são usadas para permitir a imobilização orientada ao anticorpo (mAb1). O imunossensor desenvolvido mostrou ser um método portátil, rápido, preciso, rigoroso, de baixo custo e, portanto, eficaz na deteção de gB em amostras de urina humana para a valiosa triagem de infeções por HCMV

Disposable immunosensor for diagnosis of human cytomegalovirus congenital infection

Human cytomegalovirus is a herpes virus which can cause pneumonia, retinitis, colitis and encephalopathies in immunosuppress individuals, as transplanted ones, persons infected by HIV, and individuals with immature immune system, like fetuses and newborns. In the last ones microcephaly, small body size, hepatomegaly, blindness, deafness and mental retardation can also be observed. This infection is the most frequent cause of embryogenic and fetal pathology induced by a virus. In the actuality, the diagnosis of HCMV is based on clinical and immunologic data. There are several methods for HCMV detection: the virus isolation in fibroblasts culture, the shell-vial method, the PCR technique, the ELISA test and the western blotting technique. However all of them require a long period of time to perform or are costly which is problematic for diagnosis. Therefore, an immunosensor was developed for human cytomegalovirus glycoprotein B detection based on electrochemical stripping analysis of silver nanoparticles. In this sandwich type immunosensor, the silver deposition solution is added to the electrode surface where the gold nanoparticles attached to antibodies, will catalyze the reduction reaction of silver ions, leading to the formation of silver nanoparticles. The higher concentration of analytes means that more amounts of gold nanoparticles are capture on the sensor surface, producing more silver nanoparticles. The silver nanoparticles are dissolved and measured by anodic stripping voltammetry. This method allows a faster and, we expect, a more sensitive way to detect HCMV.O Citomegalovírus humano é um vírus que pode causar pneumonia, renite, colite e encefalopatias em indivíduos immunosuprimidos, como sujeitos transplantados, infectadas com o vírus VIH e com sistema imune imaturo, como fetos e recém-nascidos. Nestes últimos, pode-se observar microcefalia, pequeno tamanho corporal, hepatomegalia, cegueira, surdez e atraso mental. Esta infecção é a causa mais frequente de patologias embriogénicas e fetais induzidas por um vírus. Na infeção aguda por HCMV são gerados anticorpos específicos para um grande número de proteínas estruturais e não estruturais. Embora o vírus codifique mais de 100 proteínas apenas as glicoproteínas B e H induzem anticorpos capazes de neutralizar o vírus e eliminar células infetadas (anticorpos neutralizantes). A glicoproteína B (gB) é o antígeno dominante existente na cápsula de HCMV e aproximadamente 100% dos indivíduos infetados com HCMV desenvolvem anticorpos contra esta proteína. Na glicoproteína B foram identificados três sítios de ligação ao anticorpo: domínio antigénico 1 (AD-1),2 (AD-2) e 3 (AD-3). O domínio AD-2 compreende dois locais, local I (resíduos 68-77) e local II (resíduos 50-54). Dos três domínios, apenas o domínio AD-1 e o local II do domínio AD-2 são capazes de induzir anticorpos neutralizantes do vírus durante a infecção natural. O domínio AD-1 representa o local imunodominante da gB. Na verdade, cerca de 100% dos indivíduos infectados que são seropositivos para gB têm anticorpos contra o domínio AD-1 enquanto o domínio AD-2 é apenas reconhecido por 47%. AD-1 é um domínio estrutural muito complexo, que tem entre 552-635 resíduos de gB. A ligação de anticorpos requer a presença da sequência completa de AD-1 e a formação de uma ligação disulfureto intramolecular entre a cisteína 573 e cisteína 610. Supõe-se que a ligação dos anticorpos a AD-1 não é afectada por glicosilação da gB, uma vez que os anticorpos também reconhecem a proteína não glicosilada. Além disto, enquanto outros domínios da molécula mostram uma variação significativa entre os isolados, o domínio AD-1 parece ser das regiões da gB mais altamente conservada. Assim, o domínio de AD-1 pode ser visto como uma fração promissora a ser usada em testes de diagnóstico para verificar a presença de anticorpos neutralizantes e pode ser utilizado para estabelecer uma relação entre a presença destes anticorpos e a ocorrência de sintomas. Atualmente, o diagnóstico de citomegalovírus humano (HCMV) é baseado em informações clínicas e imunológicas. Existem vários métodos para a deteção de HCMV. O isolamento do vírus em cultura de fibroblastos é o método convencional. Neste, é feito o isolamento do vírus a partir de um tecido de biopsia ou de um fluido corporal, tal como a urina. Após isolamento, o HCMV é replicado “in vitro”, incubado com fibroblastos a 36 °C durante uma a três semanas e posteriormente a incubação é analisada com o objetivo de identificar inclusões de HCMV em fibroblastos. Este método, que requer assepsia total, não é utilizado pois requer um longo período de tempo para sua execução, dificultando assim o diagnóstico. O método “Shell-vial” é muito similar ao anterior, mas o tempo de revelação (feito por imunofluorescência indireta) diminui para 24, 48 ou 72 horas, devido à utilização de anticorpos monoclonais contra diferentes antigénios de HCMV e à utilização de centrifugação que facilita o processo da penetração do vírus em fibroblastos. Outro método alternativo para análise de amostras clínicas é o PCR (Polimerase Chain Reaction). É uma técnica rápida (~ 6h) que apresenta uma elevada sensibilidade, baseada na amplificação seletiva de sequências específicas de ácidos nucleicos, permitindo a detecção de ADN viral. A sensibilidade e especificidade deste método é semelhante ao método de isolamento viral, mas o PCR apresenta algumas vantagens, tais como a velocidade de obtenção do resultado e a possibilidade de uso de amostras congeladas. Esta técnica é bastante utilizada apesar do seu custo elevado e dificuldade de realização. Pode ser utilizada tanto qualitativamente (diagnóstico por PCR) como quantitativamente através da medição da carga viral, que é proporcional ao nível de ADN de HCMV. Outra técnica é a de ELISA (Enzime-Linked Immunosorbent Assay), esta apresenta uma sensibilidade de 100% e uma especificidade de 86% na deteção de anticorpos no sangue. No entanto, existe a possibilidade de resultados falso-positivos, causados por reações cruzadas com algum vírus da família Herpesviridae, fator reumatóide e anticorpos antinucleares. Finalmente, outro método que pode ser usado para a deteção é o “Western Blotting”, que permite a medida da afinidade do anticorpo para o antigénio. No entanto, este método também apresenta uma disponibilidade comercial questionável, porque igualmente alguns resultados falso-positivos podem ser observados. Como descrito, todas estas técnicas de ensaio envolvem, por vezes, ou equipamentos caros e/ou procedimentos igualmente caros, demorados, complicados e conducentes a falsopositivos. As células eletroquímicas são de grande interesse na análise de substâncias devido à sua robustez, fabrico fácil e económico. Uma das técnicas mais utilizadas no fabrico dos elétrodos que se utilizam nas células eletroquímicas é a serigrafia. Esta técnica permite construir sensores químicos com uma alta reprodutibilidade e uma infraestrutura mínima. A serigrafia é um método de impressão direta, também denominado de impressão por penetração. A deposição de tintas é realizada por camadas sobre um substrato. A qualidade dos sensores químicos assim fabricados depende, em grande medida, dos materiais utilizados. Mediante a tecnologia de elétrodos serigrafados, é possível a miniaturização dos sensores, que oferecem a vantagem de terem baixo custo, serem versáteis, poderem ser fabricados com configurações de elétrodo distintas e com diferentes tintas. Devido às suas características, esta tecnologia ajusta-se bem à produção em massa de elétrodos descartáveis. Para aumentar a seletividade dos elétrodos, estes são modificados por diferentes métodos, por exemplo imobilizando uma substância na sua superfície. O método de imobilização é muito importante pois influencia o tempo de vida do sensor e a sua sensibilidade. Existem diferentes tipos de imobilização, designadamente: adsorção, aprisionamento, reticulação e ligação covalente. O dispositivo desenvolvido neste trabalho, através da sua simplicidade, baixo custo e tempo de análise relativamente curto, tem como objectivo superar todas as desvantagens referidas anteriormente para as técnicas de diagnóstico normalmente utilizadas, pois combina as vantagens dos dispositivos electródicos com o uso de anticorpos específicos para a detecção de glicoproteína B. Neste trabalho, desenvolveu-se um immunosensor do tipo sandwich. Neste é adicionada uma solução de deposição de prata à superfície onde, os anticorpos marcados com nanopartículas de ouro irão catalisar a reacção de redução dos iões de prata, levando a formação de nanopartículas de prata. Uma maior concentração de analito significa que uma maior quantidade de nanopartículas de ouro serão capturadas na superfície do eléctrodo que, por sua vez, irão levar à produção de mais nanopartículas de prata. As nanopartículas de prata são depois dissolvidas e medidas por voltametria de redissolução anódica. Este método permite uma forma mais rápida, económica e sensível para a detecção de glicoproteína B

Evaluation of a quality improvement intervention to reduce anastomotic leak following right colectomy (EAGLE): pragmatic, batched stepped-wedge, cluster-randomized trial in 64 countries

Background Anastomotic leak affects 8 per cent of patients after right colectomy with a 10-fold increased risk of postoperative death. The EAGLE study aimed to develop and test whether an international, standardized quality improvement intervention could reduce anastomotic leaks. Methods The internationally intended protocol, iteratively co-developed by a multistage Delphi process, comprised an online educational module introducing risk stratification, an intraoperative checklist, and harmonized surgical techniques. Clusters (hospital teams) were randomized to one of three arms with varied sequences of intervention/data collection by a derived stepped-wedge batch design (at least 18 hospital teams per batch). Patients were blinded to the study allocation. Low- and middle-income country enrolment was encouraged. The primary outcome (assessed by intention to treat) was anastomotic leak rate, and subgroup analyses by module completion (at least 80 per cent of surgeons, high engagement; less than 50 per cent, low engagement) were preplanned. Results A total 355 hospital teams registered, with 332 from 64 countries (39.2 per cent low and middle income) included in the final analysis. The online modules were completed by half of the surgeons (2143 of 4411). The primary analysis included 3039 of the 3268 patients recruited (206 patients had no anastomosis and 23 were lost to follow-up), with anastomotic leaks arising before and after the intervention in 10.1 and 9.6 per cent respectively (adjusted OR 0.87, 95 per cent c.i. 0.59 to 1.30; P = 0.498). The proportion of surgeons completing the educational modules was an influence: the leak rate decreased from 12.2 per cent (61 of 500) before intervention to 5.1 per cent (24 of 473) after intervention in high-engagement centres (adjusted OR 0.36, 0.20 to 0.64; P < 0.001), but this was not observed in low-engagement hospitals (8.3 per cent (59 of 714) and 13.8 per cent (61 of 443) respectively; adjusted OR 2.09, 1.31 to 3.31). Conclusion Completion of globally available digital training by engaged teams can alter anastomotic leak rates. Registration number: NCT04270721 (http://www.clinicaltrials.gov)